将兔Ⅰ型胶原α2(COL1α2)抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的兔Ⅰ型胶原α2(COL1α2)与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的兔Ⅰ型胶原α2(COL1α2)抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次*洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的兔Ⅰ型胶原α2(COL1α2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品浓度。
兔elisa检测试剂盒的操作步骤：
1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
3、配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
6、温育：操作同3。
7、洗涤：操作同5。
8、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
9、终止：每孔加终止液50μl，终止反应。
10、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：
1、试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。
2、加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，第1个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3、温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液*甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
5、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
6、底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
7、如果实验室内湿度低于60%，推荐使用加湿器提高湿度水平。
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