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兔elisa检测试剂盒是如何操作的,操作时又要注意哪些事项?

发布时间:2022-04-26   点击次数:861次
  兔elisa检测试剂盒的实验原理:
  将兔Ⅰ型胶原α2(COL1α2)抗体包被于96孔微孔板中,制成固相载体,向微孔中分别加入标准品或标本,其中的兔Ⅰ型胶原α2(COL1α2)与连接于固相载体上的抗体结合,然后加入生物素化的兔Ⅰ型胶原α2(COL1α2)抗体,将未结合的生物素化抗体洗净后,加入HRP标记的亲和素,再次*洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的兔Ⅰ型胶原α2(COL1α2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值),计算样品浓度。
 
  兔elisa检测试剂盒的操作步骤:
  1、加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
  2、温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
  3、配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
  4、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
  5、加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
  6、温育:操作同3。
  7、洗涤:操作同5。
  8、显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。
  9、终止:每孔加终止液50μl,终止反应。
  10、测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
 
  注意事项:
  1、试剂准备:准备一次实验所需要的酶标条,其它的可从微孔板上拆下,密封,按照说明书要求保存,以备下次使用。
  2、加样:实验操作中请使用一次性的吸头,避免交叉污染。加样时注意不要有气泡,将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。加样或加试剂时,第1个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的“预温育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此,一次加样时间最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
  3、温育:为防止样品蒸发,实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内,以避免液体蒸发,洗板后应尽快进行下步操作,任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态,同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
  4、洗涤:充分的洗涤非常重要,在每次洗涤过程中,都要将洗涤液*甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水,同时要消除板底残留的液体和手指印,避免影响最后的酶标仪读数。如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
  5、反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化,如颜色较深,请提前加入终止液终止反应,避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
  6、底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。
  7、如果实验室内湿度低于60%,推荐使用加湿器提高湿度水平。
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