Mouse IL-6 ELISA试剂盒原理说明

Mouse  IL-6 ELISA试剂盒原理说明

IL-6 简介： 白细胞介素 6（IL-6）是一种多功能蛋白，在宿主防御、急性期反应、免疫反应和造血中发挥重要作用。IL-6 由各种正常和转化的细胞表达，包括 T 细胞、B 细胞、单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质细胞、 星形细胞、血管内皮细胞和各种肿瘤细胞。IL-6 的产生被许多信号上调，包括有丝分裂或抗原刺激、LPS、钙 离子团、IL-1、IL-2、IFN、TNF、PDGF 和病毒。IL-6 在单核细胞中的表达受到 IL-4 和 IL-13 的抑制。

实验原理： 本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被有小鼠白细胞介素 6（IL-6）捕获抗体的 微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体，HRP 酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物 TMB 显色，TMB 在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中 的小鼠白细胞介素 6（IL-6）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

试剂盒参数： 需自备的设备及试剂： 1. 450±10nm 滤光片酶标仪 2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL. 3. Eppendorf 移液器. 4. 蒸馏水或去离子水. 5. 脱脂棉吸水纸. 6. 37℃恒温箱. 8. 准备若干个标准品稀释管. 

样本处理及要求：

1. 试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并 通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。 

2. 若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。 

3. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4℃过夜，然后 1000×g 离心 20 分钟，取上清 即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

4. 血浆：用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 2-8℃1000×g 离心 15 分钟， 取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5. 组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结 果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS（一般按 1:9 的重量体积比，比如 1g 的组织样 品对应 9mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂） 加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻 融。最后将匀浆液于 5000×g 离心 5~10 分钟，取上清检测。 

6. 细胞培养物上清：请 1000×g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免 反复冻融。

7. 其它生物标本：1000×g 离心 20 分钟，取上清即可检测。

8. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。 

9. 样品保存：样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于 4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻 存于-20℃（1 个月内检测），或-80℃（6 个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果， 因此溶血标本不宜进行此项检测。 性能 灵敏度 2.63pg/mL 检测范围 7.81-500pg/mL 特异性 可检测样本中小鼠的 IL-6，且与其类似物无明显交叉反应.

操作步骤： 1. 从室温平衡 10 分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃。 

2. 加样：分别将样品或不同浓度标准品按照 100μl 每孔加入相应孔中，空白孔加入 100μL 通用稀释液。盖 上封板膜后 37℃温育 1 小时。（建议：将待测样本用通用稀释液稀释 1 倍后再加入酶标板内测试。从 而减少基质效应对测试结果的误差影响，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和 标准品在检测中建议设立复孔）。

3. 加生物素化抗体：取出酶标板，弃去液体，不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液 100μL，盖上封 板膜后 37℃温育 1 小时。

4. 洗板：弃去液体，每孔加入 300μL 1x 洗涤液，静置 1 分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 3 次（也可用洗板机洗板）。

5. 加酶结合物工作液：每孔加入酶结合物工作液 100μL，盖上封板膜后 37℃温育 30 分钟。

6. 洗板：弃去液体按步骤 4 洗涤方法，洗板 5 次。 

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，盖上封板膜，37℃避光温育 15 分钟。 

8. 加终止液：取出酶标板，每孔直接加入终止液 50μL，立即在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

结果判断：

1. 计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

2. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线：

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

试剂盒性能：

1. 重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。

2. 回收率：在选取的健康小鼠血清、血浆和细胞培养上清中加入3个不同浓度水平的小鼠IL-6，计算回收率

3. 线性稀释：分别在选取的4份健康小鼠血清、血浆和细胞培养上清中加入高浓度小鼠IL-6，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。