人胰岛素原(PI)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明

人胰岛素原(PI)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明

PI简介：

胰岛素原(PI)是胰岛素的前体激素，它是由由胰岛β细胞合成和分泌，主要在肾脏分解代谢。生理情况下，只有极少量的胰岛素原释放入血，在病理情况下，胰岛β细胞释放胰岛素原增多，血中胰岛素原水平升高。它是细胞在裂解成成熟胰岛素之前分泌的最后一个单链蛋白结构。它是由芝加哥大学的Donald F. Steiner教授在1967年发现的。

实验原理：

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被有人胰岛素原（PI）捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体，HRP酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛素原（PI）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成：

试剂盒参数：

需自备的设备及试剂： 

1. 450±10nm 滤光片酶标仪

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸馏水或去离子水.

5. 脱脂棉吸水纸.

6. 37℃恒温箱.

8. 准备若干个标准品稀释管.

样本稀释方案：

请提前预估样本的浓度范围 ，如果您的检测样本需要稀释 ，参考稀释方案如下：

稀释 100 倍 ：一步稀释。取 5μL 样本到 495μL 通用稀释液内 ，做 100 倍稀释；

稀释 1000 倍： 两步稀释 。 取 5μL 样本到 95μL 通用稀释液内 ，做 20 倍稀 释 ，再取 5μL 20 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释 1000 倍；

稀释 100000 倍 ：三步稀释。取 5μL 样本到 195μL 通用稀释液内 ，做 40 倍 稀释 ，再取 5μL 40 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，最后 取 5μL 2000 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释100000 倍；

每步稀释时取液量不少于 3μL ，稀释倍数不超过 100 倍。每步稀释都需混合均匀 ，避免起泡。

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

检测前准备工作：

1. 请提10分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

标准品梯度工作液配制：加入1mL通用稀释液至冻干标准品中，静置15分钟待其溶解后轻轻混匀(浓度为800pg/mL)，然后按照以下浓度：800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、 100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、0pg/mL进行稀释。

倍比稀释方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀释液,200pg/mL的标准品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混匀配成100pg/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体，具体如下图。

1. 生物素化检抗工作液配制：使用前15分钟将浓缩生物素化抗体于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度(例：10μL浓缩液+990μL通用稀释液)，当日使用。

2. 酶结合物工作液配制：使用前15分钟将100x浓缩酶结合物于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度(例：10μL浓缩液+990μL通用稀释液)，当日使用。

3. 1×洗涤液配制：取10ml 20×洗涤液到190ml蒸馏水中（从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可放置室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置)。

操作步骤：

1. 从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 加样：分别将样品或不同浓度标准品按照100μl每孔加入相应孔中，空白孔加入100μL通用稀释液。盖上封板膜后37℃温育1小时。（建议：将待测样本用通用稀释液稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减少基质效应对测试结果的误差影响，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。

3. 加生物素化抗体：取出酶标板，弃去液体，不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液100μL，盖上封板膜后37℃温育1小时。

4. 洗板：弃去液体，每孔加入300μL 1x洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次（也可用洗板机洗板）。

5. 加酶结合物工作液：每孔加入酶结合物工作液100μL，盖上封板膜后37℃温育30分钟。

6. 洗板：弃去液体按步骤4洗涤方法，洗板5次。

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，盖上封板膜，37℃避光温育15分钟。

8.  加终止液：取出酶标板，每孔直接加入终止液50μL，立即在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断：

1. 计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

2. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线：

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

试剂盒性能：

1. 重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。

2. 回收率：在选取的健康人血清、血浆和组织匀浆中加入3个不同浓度水平的人PI，计算回收率

3. 线性稀释：分别在选取的4份健康人血清、血浆和组织匀浆中加入高浓度人PI，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。评估线性。