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人胰岛素(INS)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书

发布时间:2023-02-08   点击次数:1268次

人胰岛素(INS)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书

l该试剂盒用于体外定量检测人 血清、血浆或其他相关生物液体中INS的浓度。

 

实验原理:

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被有人胰岛素(INS)捕获抗体的微孔中,依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体,HRP酶结合物,中间经过温育和洗涤,用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛素(INS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

试剂盒组成:

名称

96孔配置

48孔配置

备注

预包被96孔酶标板

Pre-coated Assay Plate

8孔×12条

8孔×6条

标准品

Standard

2支

1支

按说明书进行稀释

通用稀释液

Universal Diluent

2x20mL

1x20mL

浓缩生物素化检抗100×

Biotin-antibody (100×)

120μL

60μL

按说明书进行稀释

浓缩酶结合物100×

Streptavidin-HRP (100×)

120μL

60μL

按说明书进行稀释

20×洗涤液

Wash Buffer (20×)

2x10mL

1x10mL

按说明书进行稀释

底物(TMB)

TMB Substrate

10mL

5mL

终止液

Stop Solution

6mL

3mL

封板膜

Plate Sealer

4张

4张

说明书

Instruction Manual

1份

1份


试剂盒参数:

性能


灵敏度

0.076ng/mL

检测范围

0.156-10ng/mL

重复性

板内变异系数小于10%,板间变异系数小于10%。

特异性

可检测样本中人的INS,且与其类似物无明显交叉反应

 

需自备的设备及试剂: 

1. 450±10nm 滤光片酶标仪

2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸馏水或去离子水.

5. 脱脂棉吸水纸.

6. 37℃恒温箱.

8. 准备若干个标准品稀释管.


样本处理及要求:

1. 血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

2. 血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。

4. 细胞培养物上清:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本:1000×g离心20分钟,取上清即可检测。

6. 样品外观:样品应清澈透明,悬浮物应离心去除。

7. 样品保存:样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(6个月内检测),避免反复冻融,标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

 

检测前准备工作:

1. 提前从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。

2. 标准品梯度工作液配制:加入1mL通用稀释液至冻干标准品中,静置15分钟待其溶解后轻轻混匀(浓度为10ng/mL),然后按照以下浓度:10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、 0.312ng/mL、0.156ng/mL、0ng/mL进行稀释。倍比稀释方法:取7支 EP管,每管中加入500μL通用稀释液,10ng/mL的标准品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混匀配成5ng/mL的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔,不需要再从倒数第二管中吸取液体,具体如下图。


3. 生物素化检抗工作液配制:使用前15分钟将浓缩生物素化抗体于1000×g离心1分钟,以通用稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度(例:10μL浓缩液+990μL通用稀释液),当日使用。

4. 酶结合物工作液配制:使用前15分钟将100x浓缩酶结合物于1000×g离心1分钟,以通用稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度(例:10μL浓缩液+990μL通用稀释液),当日使用。

5. 1×洗涤液配制:取10ml 20×洗涤液到190ml蒸馏水中(从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可放置室温,轻摇均匀,待结晶溶解后再配置)。

 

操作步骤:


1. 从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 加样:分别将样品或不同浓度标准品按照100μl每孔加入相应孔中,空白孔加入100μL通用稀释液。盖上封板膜后37℃温育1小时。(建议:将待测样本用通用稀释液低稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减少基质效应对测试结果的误差影响,最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔)。

3. 加生物素化抗体:取出酶标板,弃去液体,不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液100μL,盖上封板膜后37℃温育1小时。

4. 洗板:弃去液体,每孔加入300μL 1x洗涤液,静置1分钟,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板3次(也可用洗板机洗板)。

5. 加酶结合物工作液:每孔加入酶结合物工作液100μL,盖上封板膜后37℃温育30分钟。

6. 洗板:弃去液体按步骤4洗涤方法,洗板5次。

7. 加底物:每孔加入底物(TMB)90μL,盖上封板膜,37℃避光温育15分钟。

8. 加终止液:取出酶标板,每孔直接加入终止液50μL,立即在450nm波长处测定各孔的OD值。


结果判断:

1. 计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

2. 若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线:

以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

浓度(ng/mL)

10

5

2.5

1.25

0.625

0.312

0.156

0

OD值

2.22

1.56

0.92

0.63

0.42

0.25

0.18

0.08

校正OD值

2.14

1.48

0.94

0.55

0.34

0.17

0.1

-

 

 

 



试剂盒性能:

1. 重复性:板内变异系数小于10%,板间变异系数小于10%。

2. 回收率:在选取的健康人血清、血浆和组织匀浆中加入3个不同浓度水平的人INS,计算回收率

样本类型

范围

平均回收率

血清(n=8)

84-101

96

血浆(n=8)

92-105

102

细胞培养上清(n=8)

96-108

105

 

 

 

 

 

 

3. 线性稀释:分别在选取的4份健康人血清、血浆和组织匀浆中加入高浓度人INS,在标准曲线动力学范围内进行稀释,评估线性。评估线性。

稀释比例

回收率(%)

血清

血浆

细胞培养上清

1:2

范围(%)

84-95

88-96

90-110

平均回收率(%)

91

93

96

1:4

范围(%)

89-103

87-108

105-115

平均回收率(%)

94

98

108


注意事项:

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。



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