人胰岛素(INS)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书

人胰岛素(INS)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书

l该试剂盒用于体外定量检测人 血清、血浆或其他相关生物液体中INS的浓度。

实验原理：

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被有人胰岛素（INS）捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体，HRP酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛素（INS）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成：

试剂盒参数：

需自备的设备及试剂： 

1. 450±10nm 滤光片酶标仪

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸馏水或去离子水.

5. 脱脂棉吸水纸.

6. 37℃恒温箱.

8. 准备若干个标准品稀释管.

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

检测前准备工作：

1. 提前从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 标准品梯度工作液配制：加入1mL通用稀释液至冻干标准品中，静置15分钟待其溶解后轻轻混匀(浓度为10ng/mL)，然后按照以下浓度：10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、 0.312ng/mL、0.156ng/mL、0ng/mL进行稀释。倍比稀释方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀释液,10ng/mL的标准品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混匀配成5ng/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体，具体如下图。

3. 生物素化检抗工作液配制：使用前15分钟将浓缩生物素化抗体于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度(例：10μL浓缩液+990μL通用稀释液)，当日使用。

4. 酶结合物工作液配制：使用前15分钟将100x浓缩酶结合物于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度(例：10μL浓缩液+990μL通用稀释液)，当日使用。

5. 1×洗涤液配制：取10ml 20×洗涤液到190ml蒸馏水中（从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可放置室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置)。

操作步骤：

1. 从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 加样：分别将样品或不同浓度标准品按照100μl每孔加入相应孔中，空白孔加入100μL通用稀释液。盖上封板膜后37℃温育1小时。（建议：将待测样本用通用稀释液低稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减少基质效应对测试结果的误差影响，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。

3. 加生物素化抗体：取出酶标板，弃去液体，不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液100μL，盖上封板膜后37℃温育1小时。

4. 洗板：弃去液体，每孔加入300μL 1x洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次（也可用洗板机洗板）。

5. 加酶结合物工作液：每孔加入酶结合物工作液100μL，盖上封板膜后37℃温育30分钟。

6. 洗板：弃去液体按步骤4洗涤方法，洗板5次。

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，盖上封板膜，37℃避光温育15分钟。

8. 加终止液：取出酶标板，每孔直接加入终止液50μL，立即在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断：

1. 计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

2. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线：

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

试剂盒性能：

1. 重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。

2. 回收率：在选取的健康人血清、血浆和组织匀浆中加入3个不同浓度水平的人INS，计算回收率

3. 线性稀释：分别在选取的4份健康人血清、血浆和组织匀浆中加入高浓度人INS，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。评估线性。

注意事项：

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。