测定意义:线粒体复合体Ⅲ(EC 1.10.2.2)又称CoQ-细胞色素C还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C,生成还原型细胞色素C。
测定原理:与氧化型细胞色素C不同,还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收,因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。
需要的仪器,耗材:可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本处理
1、 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1.0 mL提取液,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 4 ℃ 600 g离心10min。将上清液移至另一离心管中,4 ℃ 11000 g离心15min。
3、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4、 在沉淀中加入200μL提取液,超声波破碎(功率20%,超声5秒,间隔10秒,重复15次),用于复合体Ⅲ酶活 性测定,并且用于蛋白含量测定。